关于化学制剂人体生物等效性实验研究资料

    关于新药研究本人以前对生物等效性实验接触较多，故将其相关知识和实验中注意点做一个详细的讲述，如有什么不足之处请专业人事指出。

    首先了解生物等效性评价（Bioequivalence BE）。是指同一种药物的不同制剂在相同实验条件下，给予相同的剂量，判断其吸收速度和程度有无显著差异的过程。生物等效性试验在新药开发和新药评价过程中发挥着非常重要的作用，如可比较已开发上市的药物的新剂型与原剂型是否生物等效，对仿制药物与创新药物是否具有同等有效性和安全性，比较受试药品与参比药品药动学参数的等同性等。其研究的目标，是证实等量同种药物的两种制剂生物利用度完全相同，最终使得使用相关的两种制剂时，具有相同的有效性和安全性。   

了解以下几个概念将有助于理解生物等效性，以下简称BE：

原创药（Innovator Product）：是指已经经过全面的药学、药理学和毒理学以及临床研究数据证实其安全有效性并首次被批准上市的产品。

药学等效性(Pharmaceutical equivalence)：如果两药品含有相同量的同一活性成分，具有相同的剂型，符合同样的或可比较的质量标准，则可以认为他们是药学等效的。药学等效制剂不一定意味着生物等效，因为辅料的不同或生产工艺差异可能会导致药物溶出或吸收加快或减慢。

治疗等效性(Therapeutic equivalence)：如果两制剂含有相同活性成分，并且临床上显示具有相同的安全性和有效性，可以认为两药具有治疗等效性。如果两制剂中所用辅料本身并不会导致有效性和安全性问题，生物等效性研究是证实两制剂治疗等效性最合适的办法。如果药物吸收速度与临床疗效无关,吸收程度相同但吸收速度不同的药物也可能达到治疗等效。而含有相同的活性成分只是活性成分化学形式不同（如某一化合物的盐、酯等）或剂型不同（如片剂和胶囊剂）的药物也可能治疗等效；

基本相同药物（Essentially similar product）：如果两个制剂具有相同数量且符合同一质量标准的活性成分，具有相同剂型，并且经过证明具有生物等效性,则两个制剂可以认为是基本相同药物。从广义上讲，这一概念也应适用于含同一活性成分的不同的剂型，如片剂和胶囊剂。与原创药基本相同药物是可以替代原创药使用的。

BE是评价制剂质量的重要指标，重点在于以预先确定的等效标准和限度进行的比较，是保证含同一药物活性成分的不同制剂质量一致性的依据，是判断后研发产品是否可替代已上市药品使用的依据。BE研究是在试验制剂和参比制剂生物利用度比较基础上建立等效性。目前推荐的生物等效性研究的方法包括体外和体内的方法，按方法的优先考虑程度从高到低排列：药代动力学研究方法、药效动力学研究方法、临床试验方法、体外研究方法。

BE研究具体要求

（一）生物样本分析方法的建立和确证

1. 常用分析方法

2. 方法学确证

3. 方法学质控

4. 分析数据的纪录与报告提交

（二） 实验设计与操作

1. 交叉设计

2. 受试者的选择

3. 受试制剂和参比制剂

4. 给药剂量

5. 取样

6. 药代动力学参数计算

7. 研究过程标准化

（三） 数据处理及统计分析

1. 数据表达

2.药代动力学参数

3. 统计分析

4. 群体生物等效性和个体生物等效性

（四）结果的评价

（五）提交临床报告内容 

六、结语

  下面做详细的描述：

一）生物样本分析方法的建立和确证

1. 常用分析方法 ：

目前常用的几种分析方法有：

（1）色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。

生物样本分析方法的选择宜尽量选择可行的灵敏度高的方法。一般都采用高效液相色谱法(HPLC)。

2. 方法学确证（Method Validation）

建立可靠的和可重现的定量分析方法是进行生物等效性研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法充分验证，一般应进行以下几方面的考察：

2.1．特异性(Specificity)

特异性是指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须提供证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。应确定保证分析方法特异性的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察6个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性。对于质谱法（LC－MS、LC-MS-MS）则应注意考察分析过程中的介质效应。

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2.2.标准曲线和定量范围（Calibration Curve）

标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回归分析方法（如用加权最小二乘法）所得的回归方程来评价。应提供标准曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。

配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，不同生物样品应配制标准样品制备各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。必须至少用6个浓度建立标准曲线，对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差^* 在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对

^*  ：偏差=[（实测值－标示值）/标示值]X100%标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。

2.3.定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）

定量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1／10～1／20时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明。

2．4. 精密度与准确度(Prcision and Accuracy)

精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间RSD来考察方法的精确度。一般RSD应小于15％，在LLOQ附近RSD应小于20％。

准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差)，重复测定已知浓度分析物样品可获得准确度。一般应85％～115％范围内，在LLOQ附近应在80％～120％范围内。

一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在LLOQ的3倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3个分析批(Analytical run/Analytical batch)，至少45个样品。

2.5. 样品稳定性(Stability)

根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。

2.6.提取回收率

从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以纯标准品产生的响应值即为分析物的提取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出来供分析的比例。应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应当一致、精密和可重现。

2.7. 微生物学和免疫学方法确证

上述分析方法确证主要针对色谱法，很多参数和原则也适用于微生物学或免疫学分析，但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以应采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键的因素，如果重复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤。

微生物学或免疫学分析方法确证实验应包括在几天内进行的6个分析批，每个分析批包括4个浓度（LLOQ，低、中、高浓度）的质控双样本。

3. 方法学质控

只有在生物样本分析方法确证完成之后才能开始测定未知样品。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制，以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。推荐由独立的人员配制不同浓度的质控样品对分析方法进行考核。（这样保证实验结果的准确性，也减少误差）

每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。生物等效性试验中，来自同一个体的生物样品最好在同一批中测定。每个分析批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低三个浓度的质控样品。每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3不在同一浓度的质控样品结果超限。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废。

浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白介质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到C_max以前取样的样品应以零值计算，在达到C_max以后取样的样品应以无法定量（Not detectable, ND）计算，以减小零值对AUC计算的影响。

4. 分析数据的纪录与报告提交

在分析报告中，应提交完成这些实验工作的相关资料。建立一般性和特殊性标准操作规程、保存完整的实验记录是分析方法有效性的基本要素。

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